ESTUDO DO NERVO E DA PLACA MOTORA

INTRODUÇÃO : Uma junção neuromuscular é a junção entre a parte terminal de um axônio motor com uma placa motora, que é a região da membrana plasmática de uma fibra muscular (o sarcolema) onde se dá o encontro entre o nervo e o músculo permitindo desencadear a contração muscular. Na junção neuromuscular o neurotrasmissor utilizado é a acetilcolina. A fibra nervosa ramifica-se no final, para formar a placa terminal, que se invagina para dentro da fibra muscular, mas repousa inteiramente na parte externa da membrana.

OBJETIVOS: Esta aula objetiva estudar as propriedades dos nervos e suas conexões com os tecidos musculares, os potenciais de repouso e de ação, a lei da integridade do nervo e a excitabilidade nervosa.

MATERIAL:

A) Material biológico:

- Rã (Rana sp.).

B) Reagentes e equipamentos:

- Estimulador (1)

- Material cirúrgico e linhas.

- Seringa ( 3 ml ).

- Cloreto de sódio.

- Lamparina.

- Pistola de Dubois

– Reymond (2).

- Flaxedil.

- Vidro de relógio.

- Ringer.

1- Estimulador

2. Pistola de Dubois

PROCEDIMENTOS CIRÚRGICOS:

A) TRANSMISSÃO NEURO - MUSCULAR. AÇÃO DO CURARE.

1.Destrua o sistema nervoso central do animal.

2.Segure a rã com a mão esquerda, flexionando a cabeça com o indicador;

3.Localize a articulação atlo-occipital, situada no centro da linha imaginária que tangencia o bordo inferior da mancha timpânica;

4.Seccione a medula com um bisturi;

5.Introduza o estilete (sentido caudal) no canal medular e gire o estilete várias vezes para destruir toda a medula ;

6.Dirija a ponta do estilete cranialmente e, com movimentos de lateralidade destrua o encéfalo. O animal ficará completamente imóvel;

7.Isole os dois nervos ciáticos , sem tirar completamente a pele da região para manter o saco linfático dorsal;

8.Faça uma ligadura numa das patas deixando livre o nervo ciático correspondente (observar o desenho);

PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS:

1- Estimular, isoladamente, o nervo ciático e o músculo gastrocnêmio de ambas as patas;

2- Injetar 2 ml de Flaxedil (galamina ) no saco linfático dorsal e esperar 60 minutos;

3. Excitar com estímulo isolado o nervo da pata com a ligadura e depois o músculo;

4- Excitar com estímulo isolado o nervo da pata sem a ligadura e depois o músculo.

B) POTENCIAL DE REPOUSO E POTENCIAL DE AÇÃO.

1- Preparação do animal: A rã é imobilizada por destruição do sistema nervoso central que é feita igual ao experimento anterior.

2- Preparação da pata galvanoscópica : Pata galvanoscópica, como o nome indica, compreende uma pata posterior da rã, escorchada, seccionada acima do joelho e que conserva o nervo ciático tão longo quanto possível.

   1.Após a destruição do SNC da rã, coloca-se sobre uma placa de cortiça e faz-se uma incisão circular da pele em redor da coxa.

   2.Mantém-se com a mão esquerda o segmento anterior do animal e arranca-se, com auxílio de uma pinça-dente-de-rato na mão direita, a pele dos membros posteriores da rã.

   3.Retira-se a pele com uma tração vigorosa, mas com cuidado, destacando as aderências quando necessárias.

   4.Destaca-se por meio de pinça e tesoura as aderências da pele com o ânus, retirando-se toda a pele até a altura dos membros anteriores.

 

NOTA IMPORTANTE: O tecido muscular exposto pela retirada da pele não deverá entrar em contato com a superfície externa da pele ou mesmo com o local onde esta estava tocando. Isto porque a superfície externa da pele secreta substâncias que são tóxicas aos tecidos internos e que podem tornar o músculo impróprio para as experiências. Portanto, uma vez retirada a pele deve-se trocar a placa. Deve-se também manter o tecido exposto constantemente umedecido com a solução de Ringer, para evitar que se torne seco.

Procede-se agora a dissecação do ciático em todo o comprimento, desde a articulação do joelho até a bacia, ao nível das raízes pelos quais emergem do canal raquidiano.

1.Para isso deita-se a rã sobre o ventre, de maneira que fique exposta a face posterior da coxa escorchada;

1.Percebem-se dois interstícios musculares longitudinais, um externo que separa o vasto externo do tríceps, do bíceps femoral, e um interno que separa o bíceps do semi-membranoso.

2.No fundo deste interstício interno, entre o bíceps e o semi-membranoso encontram-se o nervo ciático e os femorais .

3.Com os dois bastões de vidro pontiagudos, procede-se o afastamento dos músculos e isola-se o ciático na maior extensão possível.

NOTA IMPORTANTE: Não esquecer que o nervo não deve ser tocado com instrumentos metálicos. É preciso dissecar com grande cuidado, para evitar trações nocivas.

1.Para subir a dissecação até as origens do nervo (raízes raquidianas 7a, 8a, 9a ), tomam-se como referência, na região pélvica os dois ossos ilíacos e, no meio do seu intervalo, a 10a vértebra cóccix (na rã = hipostilo).

1.Com uma pinça levanta-se a extremidade posterior desta vértebra e, por meio de uma tesoura reta, secionam-se os músculos periformes e ileococcigeos, incisando os tegumentos em toda a espessura, sempre paralelo ao osso até a sua articulação com a 9a vértebra.

2.Rebate-se o hipostilo e, com uma tesoura corta-se ao nível da base. Deve-se ter a preocupação, nesta preparação, de não lesar os grandes vasos subjacentes ao osso: aorta abdominal e seus dois ramos de bifurcação (ilíacas).

3.Percebe-se então, além destes vasos, a direita e a esquerda, três filetes nervosos convergentes para baixo, que são as raízes dos ciáticos .

4.Ainda com bastões de vidro, disseca-se um dos grupos de raízes e. por baixo, passa-se um fio e atasse um nó, o mais alto possível. Toda a pata é sacudida por um forte abalo, que nasce em conseqüência da excitação mecânica do nervo. Repete-se o procedimento com a outra pata.

5.Secciona-se acima da ligadura e, exercendo uma leve tração sobre o segmento distal do nervo, por meio do fio, completa-se o isolamento até a extremidade inferior da coxa.

6.Rebate-se o nervo sobre a perna, aplica-se a superfície do gastrocnêmio e separa-se a perna da coxa por uma seção transversal praticada um pouco acima do joelho.

7.Colocar as patas galvanoscópicas numa superfície limpa e seca, cuidando sempre para manter úmido de Ringer a musculatura e o nervo ciático.

6. PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS:

a. Observar o potencial de repouso: Pega-se uma pata galvanoscópica (pata A) e coloca-se o nervo de modo que um ponto toque numa parte integra do tecido e outra numa porção lesada. Observar.

 

b. Observar o potencial de ação:

    - Colocar o ciático em alça da pata "A "sobre o gastrocnêmio da outra pata galvanoscópica (pata B ).

    - Excitar com estímulo elétrico o isquiático da pata " B ". Observar.

C) LEI DA INTEGRIDADE DO NERVO - PISTOLA DE DUBOIS - REYMOND.

A pistola de Dubois - Reymond consta de três eletrodos metálicos: o eletrodo do centro é de zinco, os outros dois são de cobre. Cada eletrodo comunica-se com o interruptor da pistola, que permite estabelecer contato dos mesmos aos pares.

PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS:

a. Colocar o nervo isquiático preparado previamente (pata galvanoscópica A) em relação com os três eletrodos;

b. Observar o desenho;

c) Apertar o interruptor que estabelece o contato do eletrodo número 1 de cobre mais próximo ao músculo com o número 2 de zinco. Depois proceder da mesma maneira, estabelecendo o contato do eletrodo número 3 de cobre e número 2 de zinco. Observar;

d. Passar um fio de linha sob o nervo, exatamente entre o eletrodo número 1 e o eletrodo número 2 de zinco. Apertar o interruptor que estabelece o contato dos eletrodos que ficam acima da ligadura (2 e 3 ). Observar;

e) Com um corte separar perfeitamente as duas extremidades do nervo ao nível da ligadura de tal modo que se suprima toda a continuidade física . Apertam-se os dois interruptores separadamente. Observar;

f) Restabelecer a continuidade física do nervo, pondo as duas extremidades em contato, pressionando-se sobre o interruptor que estabelece contato entre o eletrodo número 1 e número 2. Observar.

D) EXCITABILIDADE DO NERVO.

No interesse de utilizar a mesma preparação para os diversos estímulos , estes serão experimentados na ordem do que menos lesa ao mais lesivo, isto é, excitante elétrico, térmico, mecânico e químico. Será realizada na outra pata galvanoscópica

(B). PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS:

a. Excitante elétrico: estimular com o estimulador Harvard. Observar.

b. Excitante térmico: tocar o nervo da preparação com o estilete aquecido na sua porção mais distal. Observar.

c. Excitante mecânico: já na preparação da pata, ficou evidenciada a ação mecânica de uma ligadura feita na extremidade superior do isquiático. Observar.

d. Excitante químico: colocar NaCl num vidro de relógio e colocar a extremidade livre do isquiático da pata galvanoscópica. Observar.

 

 

REGULAÇÃO DA RESPIRAÇÃO NO CÃO

Introdução: Do ponto de vista da fisiologia, respiração é o processo pelo qual um organismo vivo troca oxigênio e dióxido de carbono com o meio ambiente. O oxigênio é necessário para a respiração celular, enquanto que o dióxido de carbono é um sub-produto do metabolismo e deve ser retirado do organismo. Nos vertebrados terrestres, as trocas gasosas da respiração realizam-se em órgãos denominados pulmões. A entrada e saída do ar – com composição diferente, devido às referidas trocas gasosas – é provocada pelos movimentos (geralmente involuntários) dos músculos do tórax.

Objetivo: Demonstrar os vários fatores que influem na regulação da respiração.

Material biológico: cão

Material procedimental:

- pneumógrafo

- quimógrafo

- saco plástico

- tubo de borracha

- bomba de respiração artificial

- estimulador

- seringa

- nanômetro de PSA - linha

Soluções:

•Na2Co3 – 10%

•Ácido lático – 10%

•Soro fisiológico – 9%

Procedimentos:

1.Preparação do animal

1.1.Anestesiar com Nembutal o cão com 10% a 15% menos que o recomendado (30mg/quilo de peso)

1.2.Isolar as seguintes estruturas:

- as artérias carótidas

- os nervos vagos

- a traquéia

- a veia jugular externa para colocação da cânula de polietileno

- a artéria femoral para a colocação do manômetro de PSA.

- a veia jugular para a colocação do soro

- a veia femural para a colocação da cânula de polietileno para injetar as soluções

1.3. Instalar o pneumógrafo.

Experimentação – Fatores que influem na regulação da respiração.

•EXPERIÊNCIA DE BARRY: Introduzir na veia jugular externa, em direção ao coração, uma cânula de polietileno cheio de T 1824 (Anil de Evans) e verificar a aspiração torácica durante a inspiração. A cânula deve ser fixada com um fio de linha assim como amarrada a porção mais distal da veia.

•Registro da respiração do animal

•Diminuição do espaço morto: Traqueostomia

•Aumento do espaço morto: Colocar a cânula traqueal e unir ao tubo bomba de respiração artificial desligada ou a um simples tubo.

•Ação do CO2: Adaptar na cânula traqueal com um saco plástico deixando o animal respirar seu próprio ar expirado.

•Equilíbrio ácido-básico

- injetar devagar na veia femoral, através de cânula de polietileno ácido lático a 10% de 5 a 10 ml, logo em seguida injetar 2 ml de soro fisiológico.

- injetar na veia femoral, através da cânula de polietileno Na2CO3 a 10% de 5 a 10 ml, logo em seguida injetar 2 ml de soro fisiológico.

ATENÇÃO: Entre um e outro experimento esperar que a respiração do animal retorne ao ritmo normal.

•Colocar a bomba de respiração artificial e abrir o tórax do animal

- Observar os pulmões

- Cortar os vagos, e após estimular os cabos centrais, no início da inspiração (reflexo de Hering-Brauer).

- Desligar a bomba de respiração artificial – Pneumotórax.

 

OSMOREGULAÇÃO

Introdução: Os fluidos corporais dos poliquetas são hiperosmóticos com relação ao meio e o influxo de água promove diferenças na sua concentração osmótica, isto é, o animal que apresenta seus fluídos hiperosmóticos em relação ao meio tende a absorver água e incha aumentando o seu peso. O decréscimo do peso significa que o animal é capaz de excretar alguma água e/ou gerar mudanças na sua permeabilidade corporal e/ou através da perda de sais.

Objetivo: Demonstrar as dificuldades encontradas pelos animais que se encontram em um meio hiposmótico. Material biológico: Poliqueta estuarino Laeonereis acuta

Material procedimental:

- água marinha 10 ppm (grupo 1)

- água destilada (grupo 2)

- água do mar e destilada em partes iguais (grupo 3)

- água do mar e sacarose isosmótica em partes iguais (grupo 4)

- sacarose osmoticamente equivalente a água do mar (grupo 5)

Procedimentos:

1.Cada grupo determinará o peso inicial dos animais que estão na água do mar;

2.Os animais serão transferidos para as soluções descritas anteriormente (cada grupo trabalhará com uma solução);

3.A determinação do peso será realizada a cada 15 minutos em um intervalo de 90 minutos;

4.Ao final desse período, todos os animais serão colocados novamente na água do mar e a determinação do peso será efetuada a cada 15 minutos durante 60 minutos.

 

FISIOLOGIA DO CORAÇÃO NEUROGÊNICO

Objetivos: Determinar os efeitos de neurotransmissores no coração neurogênico de invertebrados.

Material biológico: Espécie preferencialmente grande de Brachyura.

Materiais procedimentais:

Acetilcolina = 0,01 mg/ml	Adrenalina = 0,1 mg/ml	Serotonina = 0,1 mg/ml
Material cirúrgico	Vidraria comum de laboratório

Procedimentos cirúrgicos:

1.Amarre o animal em uma placa e coloque-o em uma bacia com água do mar. → O dorso do animal deve permanecer exposto.

2.Exponha o coração do animal abrindo a região cardíaca uma pequena janela. → Para tanto raspe a carapaça ao longo das linhas que delimitam a região cardíaca e retire-a cuidadosamente.

Procedimentos experimentais:

1. Observe o coração pulsando e registre a freqüência cardíaca.

2. Goteje diretamente sobre o coração serotonina, adrenalina e acetilcolina.

3.Lave o coração com água do mar entre a administração de cada droga.

4.Registre a freqüência cardíaca enquanto o coração estiver sobre o efeito de cada uma das drogas, bem como a temperatura.

 

 

FISIOLOGIA DO CORAÇÃO MIÔGENICO

 

Objetivos: Determinar os efeitos de neurotransmissores no coração miogênico de vertebrados inferiores.

Material biológico: Espécie de teleósteo ou anfíbio.

Material procedimental:

Solução fisiológica para teleósteo ou anfíbio	Material cirúrgico
Acetilcolina = 0,1 mg/ml	Vidraria comum de laboratório
Adrenalina = 0,1 mg/ml	Quimógrafo  e acessórios (1.1 e 1.2)

 

 

Procedimentos cirúrgicos:

1.Espinhale o animal e fixe-o em decúbito dorsal.

2.Exponha o coração.

3.Prenda-o a alavanca do Quimógrafo, fixando a extremidade do ventrículo ao fio que conduz a mesma.

Procedimentos experimentais:

1.Controle cuidadosamente a tensão exercida sobre o coração. Procure colocar a alavanca na horizontal e o fio o mais p erpendicular possível à mesma.

2.Coloque um cilindro enfumaçado (1.1) na base do Quimógrafo (1.2) e aproxime-o da alavanca.

3.Registre a freqüência cardíaca normal durante alguns minutos e pare o cilindro.

4.Goteje adrenalina diretamente sobre o coração e repita o registro.

5.Lave a preparação abundantemente com solução fisiológica (cilindro preparado).

6.Goteje Acetilcolina diretamente sobre o coração e repita o registro. Discussão sugerida: Descreva a regulação nervosa da atividade cardíaca nas diferentes classes de invertebrados.